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如何練就細胞計數神功?
更新時間:2022-06-09 瀏覽次數:2268
01 細胞計數的重要性
對于大多數需使用細胞系的操作,如轉染、細胞融合技術、冷凍保存和傳代培養等,有必要在操作前對細胞數進行定量。因為如果接種細胞的密度過高,實驗還沒結束細胞就會出現接觸抑制,影響細胞狀態,蛋白的表達也會受到影響;但如果密度過低最后收集到的樣品過少,檢測不到,我們要花額外的時間等待細胞長到合適的密度。
使用相同數量的細胞將保持最佳生長,并有助于使用細胞培養的程序標準化,這反過來也使結果具有更好的再現性。所以細胞計數非常重要,它是一個實驗成功的基礎。
文章開頭提到的血球計數板是以往細胞計數常用的方式,它的使用較為耗時,還易受操作者主觀判斷的影響,并且某些細胞類型,如形成簇的細胞類型,難以用這種方法計數。
02 Scepter™3.0細胞計數儀
現有的細胞計數設備可提供替代的細胞定量方法,這就包括我們的Scepter™3.0細胞計數儀。
Scepter™3.0細胞計數儀采用“計數金標準"庫爾特原理。
Scepter感應器吸入精確的樣本體積;
細胞穿過感應器小孔時,電阻值增加。電阻值的增加導致電壓的增加;
每個細胞經過時引起的電壓的增加作為一個脈沖被記錄下來;
用直徑和細胞數目繪制直方圖,脈沖的大小代表細胞的大小,脈沖的數目代表細胞的個數。
最大的特點是:
計數精準,提供基于細胞大小的直方圖(如上圖);
手持式體積小巧;
可以給出細胞體積;
可以進行復雜的混合型的細胞計數;
計數迅速,平均在30秒之內完成計數(最快14秒)。
03 檢測范圍與應用
基于細胞直徑以及樣品濃度的感應器選擇指南:
樣本濃度范圍 (個/毫升) | 50,000-1,500,000個/毫升 | 10,000-500,000個/毫升 |
直徑范圍(µm) | 4-20 µm | 6-36 µm |
適合測量的顆粒直徑范圍 | 5-15 | 8-25 |
感應器規格 | 40 µm | 60 µm |
---|
人體細胞中最小的是血小板,直徑只有約2微米;最大的是成熟的卵細胞,其直徑在200微米左右,鴕鳥卵細胞甚至可以達到長15~22厘米,直徑14至15厘米。細胞的直徑和大小會直接影響覆蓋度百分比,同樣的接種濃度,Cos7和293細胞最終的覆蓋度有著極大的區別。
讓我們來看看在分離PBMC后和流式直接對比的數據:
外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)是外周血中具有單個核的細胞,包括淋巴細胞和單核細胞。外周血單個核細胞主要的分離方法是Ficoll-hypaque(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度離心法。
離心獲得PBMC后分別染色通過流式進行分群(Lymphocyte 和Monocyte)和計數,ScepterTM3.0的結果和流式在趨勢上具有很好的相關性。
無論是分群還是計數的回歸系數都達到了0.98以上。綜上所述,Scepter3.0可以準確對PBMC細胞進行計數和分群。
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