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Amicon® Ultra超濾管 | 使用過程中的常見問題
更新時間:2024-07-25 瀏覽次數:1585
之前我們有幾期文章介紹了使用默克Amicon® Ultra超濾管的應用場景(分離外泌體、濃縮病毒),有很多老師反饋了一些超濾管使用時的問題,針對其中問的比較多的問題,小編特意進行了收集、整理。今天給大家介紹超濾管的使用過程中,離心力g與RPM的換算及常見問題的解答。
測量轉子的半徑
從離心機廠家文件上查閱轉子半徑,或像以下圖示這樣自己測量轉子半徑。
采用列線圖計算RPM
繪制轉子半徑和建議的RCF(離心力g)圖,連線確定RPM。
此列線圖實際是通過右側的公式計算得出的。
Q1:Amicon® Ultra超濾管的膜材質是什么?
A1:Amicon® Ultra超濾管的膜材質為默克密理博Ultracel®再生纖維素膜,生產工藝嚴格,截留分子量明確而精準,蛋白吸附損失最小。
Q2:如果要用超濾的方法分離兩種蛋白,那么這兩個蛋白的大小需要相差多少?
A2:按照經驗,建議兩個蛋白的分子量要相差一個數量級(10倍)。
Q3:Amicon® Ultra超濾管可以用于病毒濃縮么?
A3:可以。對于慢病毒推薦Amicon® Ultra 100 kDa; 對于腺病毒推薦Amicon® Ultra 50kDa。具體的操作步驟可以參考病毒濃縮純化試劑盒FTLV00003和FTAV00003的產品使用說明書。另提供AAV(腺相關病毒)的制備方法供參考。
Q4: Amicon® Ultrar超濾管可以用酒精消毒滅菌么?
A4:Amicon® Ultra與70%乙醇是兼容的,但是對滅菌處理的具體方法沒有做相關的測試,所以無法提供更進一步的參考信息。建議采用Ultrafree無菌離心管對濃縮后的樣品進行過濾除菌。
Q5:Amicon® Ultra超濾裝置是否可以用于高壓滅菌?
A5:Amicon® Ultra都是采用熱封設計,不可以用高壓高溫滅菌。
Q6:Amicon® Ultra超濾管是否不含RNA酶?
A6:不保證超濾管不含RNA酶,建議用0.1% DEPC在37度浸泡2h,以滅活RNA酶;殘留的DEPC可以用Milli-Q®超純水洗滌除去。
Q7:用Amicon® Ultra超濾管去除去污劑是有什么需要注意的嗎?
A7:去污劑因其性質,當濃度大于臨界微團濃度(Critical Micelle Concentration, CMC)時,去污劑分子會聚集形成微團而改變分子構象,這有可能會影響去污劑的去除效果。
Q8:蛋白在濃縮時出現了沉淀,如何改進?
A8:蛋白如果濃縮過快或者過度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后的最終濃度不超過20mg/ml。對于對濃縮速度敏感而容易沉淀的蛋白,建議的改進方法是:
-
離心力降為推薦離心力的30%-50%;
-
改用截留分子量更大的超濾管(如原本選用10k,此時可以選擇30k);
-
在濃縮過程中取出超濾管,用槍頭反復吹吸幾次后再繼續濃縮;
-
體積較大的樣品可考慮選用攪拌式超濾杯,減少沉淀的發生。
Q9:有時候用超濾離心管連水都離不下來,可能是什么原因?
A9: Amicon® Ultra超濾膜中含有微量甘油。 如果出現這種情況,請先用0.1N NaOH清洗再離心。最后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應立即使用,如暫時不用,請保持潤濕狀態,避免重新干燥。
Q10:說明書中推薦在室溫下進行離心,考慮到蛋白的穩定性,是否可以在4℃進行離心?
A10:可以,但是低溫會增加蛋白樣品的粘性,導致流速減慢,建議可將離心時間延長到原來的1.5倍。
Q11:濃縮后發現濃縮液中沒有目的蛋白,可能的原因有哪些?
A11:首先,Amicon® Ultra超濾管的蛋白zui低起始濃度為25ug/ml。請確保樣本的起始濃度大于這個濃度。其次,如果問題仍然出現,請不要丟棄樣本濾過液以便用于分析可能的原因:
· 如果目的樣本在濾過液中,那么請排查:
a)是否選擇了合適截留分子量的超濾管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3)?
b)使用的離心力是否是在限定范圍內?如果使用的是rpm,請換算成相應的g離心力,具體換算方法請垂詢。
c)離心機最近是否有校準過?
d)是否shou次嘗試這個蛋白?如果能確保用同樣的超濾管對其它蛋白成功操作的話,那么有可能是這個目的蛋白的原因。有時蛋白會因其本身的一些特性(構象差異)而影響濃縮效果,建議選用更小截留分子量的超濾管(如原本選用30k,此時可以選擇10k)。
· 如果目的樣本也不在濾過液中,那么:
a)蛋白樣本起始濃度是否大于25ug/mL?
b)用來確定樣本濃度的方法是什么?是否可信?
c)目的蛋白是不是沉淀了?如果是,具體解決方法請參考上面的關于蛋白沉淀問題的解釋。
Q12:如何對超濾管進行去除內毒素的處理?
A12:提供的超濾管是沒有經過去內毒素處理的,同時由于內毒素通常以多聚體的形式存在,大小在10-1000KD之間不等,在超濾的過程中是無法去除的。可在實驗前通過先用0.5MNaOH預清洗,隨后用Milli-Q®水/緩沖液清洗的步驟去除大部分內毒素。關于針對Amicon®、Microcon®、Centricon®嘗試過的內毒素去除方案。
Q13:用濃縮后的蛋白做下游分析時發現有干擾,可能有哪些原因?
A13:Amicon®Ultra超濾膜含有微量甘油。如果此成分干擾分析,可用緩沖液或Milli-Q®水預清洗。如果干擾仍然存在,用0.1NNaOH清洗,然后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。
Q14:懷疑濃縮過程中目的蛋白和超濾膜之間可能存在非特異性吸附,如何改善?
A14:Amicon® Ultra超濾管使用的是再生纖維素膜,這種材質是蛋白吸附zui低的超濾膜。但是對于一些疏水性蛋白或非極性蛋白,它們和膜的非特異吸附可能會增強。對于這種情況,可以嘗試在實驗前對超濾管進行封閉處理,也可以嘗試換成Amicon® Ultra 0.5或2來進行實驗,通過減小膜面積來降低非特異性吸附。
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